RNase概念

核糖核酸酶(Ribonuclesae，RNase)是一類催化RNA降解為小片段的核酸酶。RNase 家族包括RNase A、RNase B、RNase C、RNase H、S-RNase、RNase P、RNase T等。其中，RNaseA是一種有廣泛應(yīng)用的核酸內(nèi)切酶，RNase A在嘧啶核苷酸殘基C和U的3'端處高效且專一地催化單鏈RNA鏈骨架上的磷酸二酯鍵的裂開，形成具有2'，3'-環(huán)磷酸衍生物的寡聚核苷酸。

RNase污染的危害

核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶(DNase)類似，廣泛存在于實(shí)驗(yàn)環(huán)境，從研發(fā)階段的實(shí)驗(yàn)操作、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，到生產(chǎn)階段的商品化試劑、生化制劑等，都極易發(fā)生RNase污染，因此，對(duì)核糖核酸酶活性的監(jiān)測是一個(gè)常規(guī)質(zhì)量控制(QC)步驟。

RNase檢測方法

目前，常見的RNase殘留檢測方法主要包括放射性同位素法、分光光度法和熒光淬滅方法、電化學(xué)法等等，分光光度法存在檢測靈敏度低、不適合微量核酸酶殘留的活性檢測的缺陷，電化學(xué)法則受限于儀器設(shè)備，相比之下，熒光探針法靈敏度高、檢測速度快且能實(shí)現(xiàn)核酸酶活性的定量檢測，因此被認(rèn)為是核酸酶殘留活性檢測的最佳選擇之一。寶銳生物自主研發(fā)基于熒光探針法的RNase殘留檢測試劑盒，可用于檢測環(huán)境、耗材、原料中的RNase殘留量，為相關(guān)質(zhì)量檢測提供重要的數(shù)據(jù)參考。

RNase殘留檢測原理

RNase底物是一種合成的RNA寡核苷酸探針，其一端具有FAM熒光基團(tuán)(Fluorophore)又稱供體(Donor)，另一端具有 TAMRA淬滅基團(tuán)(Quencher)又稱受體(Acceptor)。這兩個(gè)基團(tuán)的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光基團(tuán)間的距離合適時(shí)，熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致供體熒光分子自身的熒光強(qiáng)度衰減。當(dāng)該底物被RNase切割后，底物首尾兩端分離，兩個(gè)基團(tuán)分開，F(xiàn)AM的熒光不再被TAMRA淬滅，即可檢測到FAM的熒光，熒光信號(hào)的增加速率與酶的數(shù)量和活性呈正相關(guān)。使用熒光酶標(biāo)儀在ex/em =490/520nm(RNase)的波長下測量，可以確定樣品是否有RNase污染，這樣通過熒光檢測就可以非常靈敏地檢測核酸酶的酶活性。

圖1 寶銳RNase核酸酶殘留檢測試劑盒檢測原理圖

經(jīng)驗(yàn)證，該試劑靈敏度可達(dá)0.078pg。

圖2. 寶銳RNase殘留檢測試劑盒靈敏度檢測效果

經(jīng)驗(yàn)證RNase A在0-10pg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，R2>0.99，可以通過設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中RNase A的活性。本試劑盒應(yīng)用于RNase A酶的檢測結(jié)果參考圖4。

圖3. 60分鐘內(nèi)本試劑盒檢測不同量的RNase A的熒光強(qiáng)度變化圖

圖4. 寶銳RNase 殘留檢測試劑盒對(duì)RNase A標(biāo)準(zhǔn)品的檢測效果