3分鐘！了解限制性核酸內(nèi)切酶在mRNA藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用

2023-08-11 09:44:00

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前言

限制性核酸內(nèi)切酶是用來(lái)識(shí)別特定的脫氧核苷酸序列，并對(duì)每條鏈中特定部位的兩個(gè)脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類(lèi)酶。在分子生物學(xué)研究中，限制性核酸內(nèi)切酶廣泛應(yīng)用于DNA基因組物理圖譜的組建、基因的定位和基因分離、DNA分子堿基序列分析、相關(guān)DNA分子和遺傳工程、基因工程編輯。

在過(guò)去的幾年里，mRNA疫苗和基因治療產(chǎn)業(yè)化得到了快速發(fā)展，新冠mRNA疫苗的上市極速推動(dòng)了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。實(shí)際情況的緊迫需求以及 mRNA技術(shù)自身無(wú)限的臨床應(yīng)用前景都使得mRNA在生物行業(yè)舉足輕重。mRNA疫苗屬于第三代疫苗，本質(zhì)為核酸疫苗。經(jīng)優(yōu)化設(shè)計(jì)的外源mRNA導(dǎo)入細(xì)胞后可利用胞內(nèi)的蛋白組裝系統(tǒng)進(jìn)行翻譯，從而產(chǎn)生相應(yīng)的抗原，激活免疫系統(tǒng)。

mRNA規(guī)?；a(chǎn)主要依靠體外轉(zhuǎn)錄，一段DNA模板在RNA 聚合酶的作用下利用NTP為底物進(jìn)行酶促反應(yīng)，1μg的DNA模板通常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量能達(dá)到100-200μg左右。在此過(guò)程中，DNA模板作為重要的信息載體承擔(dān)重要的任務(wù)。盡管目前市面上推出類(lèi)似“一鍋法”mRNA制備工藝，但DNA作為mRNA生產(chǎn)過(guò)程中的中間品，對(duì)批間穩(wěn)定性，工藝穩(wěn)定性等方面的研究仍有不可替代的作用。

用作轉(zhuǎn)錄的DNA模板通常由兩種方式制備，首先是PCR的方式，引物設(shè)計(jì)通常會(huì)選擇在T7啟動(dòng)子上游和poly(A)模板下游，以得到一段帶有T7啟動(dòng)子的模板序列。這種采用擴(kuò)增的方式制備DNA模板在研究階段尚可行，受限于PCR復(fù)雜的溫度控制，PCR制備模板的方式在mRNA的工業(yè)生產(chǎn)中用途有限。

PCR擴(kuò)增制備體外轉(zhuǎn)錄模版位點(diǎn)示意

限制性?xún)?nèi)切酶制備體外轉(zhuǎn)錄模版位點(diǎn)示意

得益于基因治療的發(fā)展，質(zhì)粒的工業(yè)化生產(chǎn)至今已有數(shù)十年的歷史，發(fā)展相對(duì)成熟。研究者發(fā)現(xiàn)將質(zhì)粒作為mRNA工業(yè)化生產(chǎn)的模板具有先天優(yōu)勢(shì)。借助于基因治療中質(zhì)粒的發(fā)展和純化工藝，能迅速得到合格的用于mRNA生產(chǎn)的質(zhì)粒。

基因治療中使用的質(zhì)粒通常具有閉合環(huán)狀的超螺旋結(jié)構(gòu)。在mRNA制備過(guò)程中，借助于質(zhì)粒中的T7啟動(dòng)子，RNA聚合酶能高效地轉(zhuǎn)錄T7下游的序列。體內(nèi)轉(zhuǎn)錄的終止發(fā)生時(shí)往往通過(guò)依賴(lài)ρ因子和不依賴(lài)ρ因子的方式進(jìn)行，而體外轉(zhuǎn)錄受限于質(zhì)粒的特殊結(jié)構(gòu)，往往需要人為制造轉(zhuǎn)錄的終止位點(diǎn)。

出于穩(wěn)定性和免疫原性考慮，mRNA的模板設(shè)計(jì)通常需要在3'添加長(zhǎng)度為70-110的poly(A)序列，因此轉(zhuǎn)錄終止的位點(diǎn)往往限定在緊鄰poly (A)序列的末尾，而限制性?xún)?nèi)切酶成為首選，此過(guò)程被稱(chēng)為質(zhì)粒模板線(xiàn)性化。

使用限制性?xún)?nèi)切酶制備mRNA轉(zhuǎn)錄模板具有以下優(yōu)勢(shì)：

適合工藝放大

使用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行模板的制備只需要在純化質(zhì)粒的基礎(chǔ)上增加酶切的過(guò)程，隨后利用上游質(zhì)粒的純化平臺(tái)再次進(jìn)行線(xiàn)性化模板的回收。根據(jù)實(shí)際需要，酶切體系較為容易放大，在mRNA的工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，往往借助生物反應(yīng)器實(shí)現(xiàn)此過(guò)程。

不受序列影響

限制性?xún)?nèi)切酶種類(lèi)極為豐富，用于質(zhì)粒模板線(xiàn)性化的限制性?xún)?nèi)切酶有多種選擇，因此，使用限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行線(xiàn)性化模板的制備時(shí)能夠不受內(nèi)部序列的影響，可以靈活選擇不同限制性?xún)?nèi)切酶。

不會(huì)額外引入其他復(fù)雜雜質(zhì)

酶切反應(yīng)體系簡(jiǎn)單，成分清楚，反應(yīng)完成后，只需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的層析即可有效除去反應(yīng)產(chǎn)物中的蛋白分子以及各種小離子，經(jīng)過(guò)初步純化后的酶切產(chǎn)物，其純度基本已達(dá)到下游轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)的要求。

用于mRNA制備的限制性?xún)?nèi)切酶與普通限制性?xún)?nèi)切酶的差異：

高效穩(wěn)定

質(zhì)粒模板的線(xiàn)性化在整個(gè)mRNA的生產(chǎn)過(guò)程中雖然是相對(duì)簡(jiǎn)單的一步，但線(xiàn)性化模板的質(zhì)量直接決定了下游轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的質(zhì)量，因此選擇一款高效、穩(wěn)定的限制性?xún)?nèi)切酶尤為重要，這也對(duì)限制性?xún)?nèi)切酶在批次、存儲(chǔ)方面的穩(wěn)定性有了更高的要求。

無(wú)動(dòng)物源配方和生產(chǎn)過(guò)程

由于GMP級(jí)輔料具有嚴(yán)格的質(zhì)量要求，因此，在內(nèi)切酶生產(chǎn)中，從菌體培養(yǎng)發(fā)酵，到酶原液制備，均使用無(wú)動(dòng)物源試劑和輔料，所配套使用的反應(yīng)緩沖液在配制過(guò)程中也使用無(wú)動(dòng)物源類(lèi)試劑。

避免產(chǎn)生 3'突出末端

用于制備線(xiàn)性化模版的限制性?xún)?nèi)切酶通常識(shí)別位點(diǎn)位于切割位點(diǎn)之外，因此，通過(guò)序列設(shè)計(jì)，改造完成的質(zhì)粒在使用這類(lèi)限制酶切割時(shí)，可產(chǎn)生帶有完整且單獨(dú)的poly(A)結(jié)構(gòu)，對(duì)下游mRNA的穩(wěn)定性更加有利，且消除了poly(A)后多余序列的影響。此外，3'突出末端序列可增加副產(chǎn)物dsRNA的產(chǎn)生，增加mRNA產(chǎn)物的免疫原性，對(duì)后續(xù)的給藥臨床階段帶來(lái)困難。

盡可能選擇反應(yīng)溫度為37℃的酶

對(duì)于工業(yè)化生產(chǎn)，溫度控制是一項(xiàng)比較繁瑣的過(guò)程，大多數(shù)生物反應(yīng)因?yàn)槊傅膮⑴c需要在37℃進(jìn)行。某些特殊的限制性?xún)?nèi)切酶要求更高的溫度，實(shí)質(zhì)上，此類(lèi)限制性?xún)?nèi)切酶并不適用于工藝放大，因此在內(nèi)切酶的選擇上，盡可能選擇反應(yīng)溫度在37℃的酶，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。