表觀遺傳學(xué)是指在基因組的核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，生物個體表型卻發(fā)生了可遺傳性變化的現(xiàn)象。DNA甲基化是目前研究最深入的表觀遺傳修飾，簡言之，是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，將活性甲基轉(zhuǎn)移至DNA鏈中特定堿基的化學(xué)修飾過程，在哺乳動物中，主要生成為5-甲基胞嘧啶（5-mC）。

圖1-在DNA甲基化催化酶(DNMT)作用下，胞嘧啶甲基化的過程

DNA甲基化可以發(fā)生在胞嘧啶的C-5位、腺嘌呤的N-6位、鳥嘌呤的N-7位等，它們分別由不同的DNA甲基化酶催化，生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）、N6-甲基腺嘌呤（N6-mA）及7-甲基鳥嘌呤（7-mG）。

圖2-堿基中甲基化發(fā)生的位置示意圖

Dam甲基化：在GATC序列中腺嘌呤N6位發(fā)生甲基化。

Dcm甲基化：在CCAGG和CCTGG序列中第2個胞嘧啶C5位發(fā)生甲基化。

CpG甲基化：在真核生物（如植物和哺乳動物）中，影響酶切最常見的甲基化類型為CpG 甲基化。CpG甲基轉(zhuǎn)移酶將甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶殘基的C5位置。

當(dāng)甲基化位點與限制性內(nèi)切酶識別序列發(fā)生重疊，大部分酶切會受到阻斷或影響。

圖3-dam，dcm，CpG甲基化示意圖

根據(jù)以上內(nèi)切酶的甲基化敏感性，對部分甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶進行統(tǒng)計和分類，如下表：

備注：下劃線表示內(nèi)切酶識別的序列，彩色標(biāo)記的堿基表示會發(fā)生甲基化修飾的序列。

隨著 DNA 甲基化被發(fā)現(xiàn)，人們開始不斷的探索如何更好更便捷地對 DNA 甲基化進行研究。對于生物體而言，基因位點的甲基化的改變可能會導(dǎo)致基因表達的改變，因此，對于位點上甲基化水平的研究就尤為重要。目前比較常用的就是利用甲基化敏感酶對基因組 DNA 序列進行識別切割的方法對單個位點的甲基化水平進行研究。

甲基敏感的限制性內(nèi)切酶 PCR（Methyl-Sensitive Restriction Enzymes PCR）：該方法較為久遠(yuǎn)，原理是甲基化敏感酶（如 HpaⅡ）對酶切位點中的 CG 甲基化敏感的特性，如果酶切位點的 CG 屬于低甲基化，則可以被切開，PCR 擴增后和對照相比沒有條帶或者 條帶很暗，相反如果酶切位點的 CG 屬于高甲基化，則不會被切開，PCR 擴增后和對照 相比條帶亮度相當(dāng)，可以通過電泳的結(jié)果快速地判斷位點甲基化水平的高低，這種方法操作簡單成本低而且結(jié)果容易觀察。

圖4-甲基敏感的限制性內(nèi)切酶檢測DNA甲基化

在上述方法的基礎(chǔ)上發(fā)展出更精確的甲基化定量分析，即使用熒光定量PCR（qPCR）對甲基化酶切后的底物進行檢測。在目標(biāo)位點側(cè)翼上下游設(shè)計PCR引物，未被酶切的DNA可以作為PCR模板擴增，而被切開的DNA理論上無法擴增。剩余未酶切DNA的水平取決于目標(biāo)位點的甲基化程度，位點甲基化程度越高，能被HpaII切割的片段就越少，可供PCR擴增的DNA模板就越多，在qPCR中就越早檢測到DNA擴增（即Ct值越低）。根據(jù)這一原理，依據(jù)qPCR分析即可測定位點的甲基化狀態(tài)。

圖5-甲基敏感的限制性內(nèi)切酶檢測DNA甲基化

目前比較常用的就是利用甲基化敏感酶對基因組 DNA 序列進行識別切割的方法對單個位點的甲基化水平進行研究。甲基化敏感的內(nèi)切酶在甲基化分析和檢測領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。下圖展示了甲基化分析方法的發(fā)展歷程，從液相色譜分析到二維電泳，再到3代測序技術(shù)在甲基化分析中的應(yīng)用，伴隨著甲基化測序技術(shù)的不斷發(fā)展，甲基化敏感的內(nèi)切酶參與的甲基化測序的方法也同樣不斷更新迭代。

目前主要應(yīng)用多集中在樣品的前處理步驟，通過聯(lián)合亞硫酸鹽測序和高通量測序等各種平臺分析，從而進行整體和特定區(qū)域的甲基化水平分析。

圖6-甲基敏感的限制性內(nèi)切酶檢測DNA甲基化

產(chǎn)品：HinP1Ⅰ, HhaⅠ, AciⅠ, HpaⅡ, BssHⅡ, BsrFⅠ, BspEⅠ.

產(chǎn)品特點

特異性：酶切識別特異性強，產(chǎn)物清晰。

高效率：驗證酶切效率高。達到或優(yōu)于進口產(chǎn)品。

高保真：過夜酶切，星號活性極低。

寶銳甲基化敏感內(nèi)切酶酶切效率高，酶切產(chǎn)物清晰，酶切產(chǎn)物的條帶均一，無非特異性切割，即無星活性現(xiàn)象，達到或優(yōu)于進口N公司產(chǎn)品。

參考文獻：