重組蛋白技術(shù)的原理是利用 DNA 重組技術(shù)，將外源蛋白基因連接到合適的表達(dá)載體并通過宿主細(xì)胞的生物機(jī)制使其表達(dá)進(jìn)而得到理想的重組蛋白。重組蛋白表達(dá)通常會通過添加融合標(biāo)簽的方式來提高目的蛋白的溶解性和促進(jìn)目的蛋白的折疊等，根據(jù)實際需求，某些融合標(biāo)簽需要被去除。在獲得目的蛋白前，需要特定的蛋白酶將融合標(biāo)簽切除。常用的蛋白酶有腸激酶、凝血酶、Factor Xa等，它們的酶切最適溫度在25-37℃，此溫度范圍會使得一些目的蛋白被非特異性酶切。
表1.常見的用于切除標(biāo)簽的蛋白酶
人鼻病毒(HRV)是單股正鏈小RNA病毒，其編碼的3C蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶家族，HRV 3C蛋白酶能特異性地識別七肽序列Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly，并在Gln和Gly氨基酸殘基之間進(jìn)行酶切，主要用于切除融合蛋白的標(biāo)簽，如GST、His等。
寶銳生物的HRV 3C蛋白酶突變體，分子量40kDa，可識別切割LEVLFQ↓G，酶切后，在目的蛋白的N端僅有一個額外的Gly氨基酸殘基，從而最大限度地減少了對目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響。寶銳HRV 3C也可以識別切割LEVLFQ↓M位點。
圖1.HRV 3C 蛋白酶識別切割序列
寶銳生物利用基因工程表達(dá)的HRV 3C Protease的最佳酶切溫度是4℃，特異性強(qiáng)，酶切后的產(chǎn)物清晰，與主流品牌的產(chǎn)品酶切效果相當(dāng)。
不同酶量下切割100μg底物蛋白效率驗證：
取寶銳生物和N公司HRV 3C Protease按照4U、2U、1U的酶投入量，4℃反應(yīng)過夜后取樣做SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色。反應(yīng)體系如下：
備注：substrate protein為融合蛋白-LEVLFQ↓G-目標(biāo)蛋白，約66kDa，使用HRV 3C Protease 酶切后會獲得約40kDa的融合蛋白和26kDa的目標(biāo)蛋白。
實驗結(jié)果如下：
寶銳 HRV 3C Protease的表現(xiàn)力與進(jìn)口N公司的產(chǎn)品相當(dāng)。
實驗結(jié)論
寶銳生物 HRV 3C Protease在4℃ 過夜的條件下能夠完成底物蛋白的切割，酶切產(chǎn)物清晰，酶切產(chǎn)物的條帶與進(jìn)口N公司的產(chǎn)品一致，無非特異性切割。
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