二、熔解曲線

熔解曲線(Dissociation curve)是隨溫度升高DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)降解程度的曲線。它用于分析PCR產(chǎn)物的濃度、特點和純度。

原理：PCR反應(yīng)結(jié)束后，通過逐漸增加溫度同時監(jiān)測每一步的熒光信號來產(chǎn)生熔解曲線。隨著溫度上升，DNA雙鏈逐漸解開，熒光染料從雙鏈中釋放出來，熒光信號降低。當(dāng)溫度達(dá)到DNA雙鏈解鏈50%時，對應(yīng)的溫度稱為熔解溫度(Tm)。

曲線分析：單峰曲線:如果qPCR產(chǎn)物非常特異，熔解曲線在80-90℃之間會形成一個單峰。這表明只擴增到了目的基因，沒有非特異性擴增產(chǎn)物。

前置雜峰：在主峰前有一個前鋒，可能是比目的片段短些的非特異性片段，在溫度低一些的時候就能解開雙鏈，也可能是引物二聚體。

后置雜峰：躲在主峰后面的是比目的片段長些的非特異性片段，在溫度高一些的時候才能解開雙鏈。

寬峰：如果非特異性產(chǎn)物Tm值與目的條帶的Tm值接近，熔解曲線可能出現(xiàn)寬峰。

擴增循環(huán)數(shù)(Cycle Threshold，Ct)在qPCR(實時熒光定量PCR)中是一個關(guān)鍵參數(shù)，代表PCR擴增過程中，熒光信號達(dá)到設(shè)定的熒光閾值時所對應(yīng)的擴增循環(huán)數(shù)。

Ct值的定義

Ct值:全稱為CycleThreshold，即在PCR反應(yīng)中，每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。簡單來說，就是熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。 

Ct值的意義與范圍

Ct值與模板量的關(guān)系:ct值與起始模板量的對數(shù)存在線性關(guān)系。起始模板量濃度越高，ct值越小;起始模板量濃度越低，ct值越大。

Ct值的范圍:在正常情況下，Ct值的范圍通常在15-35之間。Ct值小于15可能意味著擴增在基線期范圍內(nèi)，未達(dá)到熒光閾值;而ct值大于35則可能意味著模板起始拷貝數(shù)過低，擴增效率不佳或存在非特異性擴增，結(jié)果無意義。