什么是凍干?

冷凍干燥，全稱真空冷凍干燥，簡稱凍干，是指將含有大量水分的物料預先進行降溫，凍結成冰點以下的固體，在真空條件下使冰直接升華。從而去除水分得到干燥產(chǎn)品的一種技術。如今已經(jīng)廣泛應用于食品、藥品、生物制品等領域。

不同于食品或?qū)櫸锪闶车葍龈僧a(chǎn)品，往往只需要將水分去除以便更好地保存和運輸；常規(guī)體外診斷檢測試劑中含有生物活性成分(各種酶類及蛋白類添加劑等)，除了應對運輸?shù)男枨?，還需要確保其在凍干復溶后仍然能夠正常工作，并且功能可以和凍干前的液體試劑保持基本一致。

然而整個凍干過程中存在許多應力，包括低溫應力、凍結應力(枝狀冰晶的形成、離子強度的增加、pH值的改變、相分離等)、干燥應力(失去蛋白質(zhì)表面水分子)等，這些應力常常直接或間接導致蛋白質(zhì)類等活性組分失去天然構象從而變性或失活。那么這時候就需要凍干保護劑來對這些活性組分進行保護了。 

除了功能性，凍干后的形態(tài)是否正常也是凍干成功的指標之一

凍干保護劑對于蛋白質(zhì)的保護原理已經(jīng)被研究討論了幾十年，雖然沒有形成統(tǒng)一的理論，但還有一些被普遍接受的認識。凍干保護劑在冷凍干燥過程中的凍結與干燥階段對于蛋白質(zhì)的保護作用原理不同。

在凍結階段，最主要的假說為“優(yōu)先化作用”，即蛋白質(zhì)周圍有一層水化層，可以保持其性質(zhì)及構象的穩(wěn)定。其中有兩個優(yōu)先，“優(yōu)先水合”和“優(yōu)先排斥”。

蛋白質(zhì)溶液在達到最大凍結濃縮濃度以前優(yōu)先與水作用并排斥保護劑分子，蛋白質(zhì)化學勢增加，表面有更多水分子，保護劑加入后可能與蛋白質(zhì)表面或個別氨基酸、肽主鏈等位點發(fā)生非特異相互作用，優(yōu)先從蛋白質(zhì)表面進入溶液中，保護了其天然構象。 

在干燥階段最主要的有2種假說，即“玻璃化”和“水置換”。

所謂玻璃化是指物質(zhì)以非晶態(tài)形式存在的一種狀態(tài)，黏度極大，具有液體的性質(zhì)，但由于黏度大，分子運動受到限制，流動性差。玻璃化狀態(tài)與溫度密切相關，當溶液濃度達到最大凍結濃縮狀態(tài)發(fā)生玻璃化轉(zhuǎn)變時的溫度稱為玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg )。

在凍干過程中，如果溫度高于產(chǎn)品的Tg，就會使產(chǎn)品黏度迅速降低，表面萎縮，微觀結構破壞，發(fā)生塌陷現(xiàn)象。玻璃化狀態(tài)保護蛋白質(zhì)理論的基礎是將蛋白質(zhì)固定在剛性的、非晶態(tài)的玻璃糖基質(zhì)中，分子構象互變及構象松弛減慢，從而維持了分子的結構和功能。

在凍干過程中，蛋白質(zhì)溶液中的保護劑與蛋白質(zhì)分子中多個氨基、羥基和羧基之間相互作用，增加了冷凍混合物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，大大增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。

水置換理論是指在干燥過程中，保護劑會與蛋白質(zhì)形成氫鍵，從而取代水和蛋白質(zhì)之間的氫鍵，這樣可保護氫鍵的聯(lián)結位置不直接暴露在周圍環(huán)境中，通過這種替代的氫鍵使蛋白質(zhì)的天然構象得以保持。

過去，較多研究者贊同“水置換”假說。但Grasmei-jer等發(fā)現(xiàn)，在蛋白質(zhì)凍干制劑的貯藏過程中，只要有足夠高的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，即Tg比貯藏溫度高10～20℃時，水置換是主要的穩(wěn)定機制；然而，當儲存溫度接近或超過Tg時，玻璃化成為穩(wěn)定的限制因素。這說明保護劑對蛋白質(zhì)的保護是一個復雜的問題，沒有一個統(tǒng)一的理論能夠完全解釋，蛋白質(zhì)在各種過程中的穩(wěn)定機制，不能用一種假設來解決。

海藻糖在失水狀態(tài)下對結構的維持作用

不管是何種假說，對于凍干保護劑應該遵循的原則是基本一致的：防止活性組分變性。

按照功能可以把凍干保護劑分類，包括5類：

① pH緩沖劑，如三羥甲基氨基甲烷(Tris)、組氨酸、枸櫞酸等;

② 配體，可以優(yōu)化蛋白質(zhì)的熱力學穩(wěn)定性;

③ 穩(wěn)定劑，一般是雙糖，如蔗糖、海藻糖等，可通過抑制蛋白質(zhì)的展開和提供玻璃基質(zhì)起保護作用;

④ 非離子表面活性劑，可減少蛋白質(zhì)的聚集;

填充劑，如甘露醇、甘氨酸、羥乙基淀粉、血清白蛋白等，可提高產(chǎn)品的物理成型性。凍干物料總的固態(tài)成分小于2%時通常需向其中加入填充劑。

1. 保護劑的成分不影響pcr反應本身，或者最大程度避免反應體系受到抑制。

2. 保護劑作為固劑在升華時不會崩塌，保護酶活性同時保證了凍干制品的形態(tài)。

3. 凍干后的制品干燥疏松多孔結構，使得復溶過程時間縮短。

4. 凍干后真空儲存，可在室溫下長期保存。

1. 保護劑兼容性不足，在面對復雜的體系或者存在低Tg組分時易導致凍干失敗。

2. 由于結構的疏松多孔，復溶快速的同時也存在易快速吸潮，引起活性成分活性喪失。

3. 成分較為單一，難以兼顧各個評價指標。例如出箱形態(tài)正常，但在面對37℃或45℃甚至更高溫度的加壓測試下容易出現(xiàn)萎縮的情況。

上述缺點中大多集中在功能性驗證上的攻克上，但是往往忽略了一個重要的問題，就是凍干結構帶來的極易吸潮的特點。傳統(tǒng)的醫(yī)藥類生物凍干制品主要是在西林瓶中進行冷凍干燥的，凍干完成后，利用凍干機板層的升降來進行壓蓋，完成西林瓶的初步密封，隨后出倉轉(zhuǎn)移到低濕車間內(nèi)進行二次密封。然而，對于分子診斷試劑而言，其凍干容器往往是PCR管、8連管、96孔板等，是非傳統(tǒng)凍干用的標準容器，進一步提高了自動壓塞的門檻，往往需要出倉后進行人工加蓋封裝。而如果是將反應試劑制備成凍干球，則需要凍干出倉后的分裝操作，將凍干球分裝到檢測容器內(nèi)進行加蓋密封。因此，對這些無法在凍干機內(nèi)進行壓蓋的產(chǎn)品，需要在出倉時、分裝時、加蓋時均在低溫低濕的環(huán)境(通常濕度要求10％或更低)中進行。

為了達到這樣的要求，要么進行全車間濕度、溫度控制，這樣極端的溫濕度控制會造成極大的能源消耗；要么定制隔離罩或手套箱等，通過向隔離罩或手套箱通高純度惰性氣體來降低濕度。但隔著厚厚的手套進行分裝、加蓋等操作，會極大降低生產(chǎn)效率。而且在產(chǎn)量較高的情況下，需要增加人力，如果人員不夠，關蓋速度慢，同一批次干燥制劑與空氣接觸的時間不同，造成差異，而且如果長時間暴露在空氣中，容易吸潮復水，極大地影響了產(chǎn)品的出現(xiàn)質(zhì)量。所以在凍干制品中所含的水量越低，其穩(wěn)定性就越高，但含水量高低，也直接影響著凍干成本。

所以考慮到這些因素，提出了一個要求就是，能否開發(fā)一款凍干保護劑，既能繼承常規(guī)保護劑的優(yōu)點，同時在一定的濕度條件下敞口放置一段時間后再進行封裝，來模擬長時間分裝的情景，仍然能夠?qū)罄m(xù)凍干制品的保存有一定的保障。

寶銳生物通過對凍干保護劑的配方進行重新調(diào)整和研發(fā)，開發(fā)了新的抗吸濕凍干保護劑，對搭配新抗吸濕凍干保護劑的凍干品進行室溫、20-25%濕度敞口放置4h后再進行蓋蓋真空包裝。

對上述處理的凍干品進行55℃加速30d，形態(tài)保持正常且在不同檢測體系下的擴增性能仍然能夠和液體對照組保持基本一致。

注：

1. 對照組為不加凍干保護劑的液體試劑；

2. 敞口4h加速組：指在25℃、20-25%濕度下，打開蓋子敞口4h，再蓋上蓋子，放入鋁箔袋抽真空密封包裝，再放入55℃烘箱加速的樣品。

注：對照組為不添加凍干保護劑的液體試劑

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