作者：木子莊主 

文章來源： 分子莊園

核酸作為一種生物大分子，之所以能夠在水溶液中穩(wěn)定分散不沉淀，是由于三種非共價作用力的存在：靜電相互作用、范德華力、氫鍵。

核酸分子具有多個磷酸基團，呈現(xiàn)高度負電性，分子間互相排斥從而避免發(fā)生團聚。

此外，核酸分子在水溶液中通過氫鍵與范德華力結合了大量的水分子在其周圍，形成一個水化層，也阻止了分子間的聚集。

圖片來源：水環(huán)境對GC和AT堿基對質子轉移的影響

因此，要使得核酸分子結合到磁珠表面，就必須削弱上述作用力，屏蔽溶液中的靜電斥力，同時破壞核酸分子表面的水化層，使其能夠與磁珠表面相接觸，進而產生吸附。

在經過裂解的混合液中加入磁珠，當液體環(huán)境為偏酸性(PH5.0)時， 游離的DNA分子被吸附到磁珠上。在洗滌后的磁珠中加入偏堿性(PH8.0)的TE緩沖液即可將磁珠與DNA分離，從而得到純凈的DNA溶液。

1、提取磁珠的種類

1）羥基修飾磁珠

羥基磁珠表面修飾大量的硅烷醇基團(羥基)，能在高鹽低pH條件下和溶液中的核酸通過疏水作用、氫鍵作用和靜電作用等發(fā)生特異性吸附，而不與其他雜質(如蛋白)結合。

使用硅羥基磁珠提取核酸時，通常需要高濃度的離液鹽（NaI（碘化鈉）、NaClO?（高氯酸鈉）、GuHCl（鹽酸胍）、GuSCN（異硫氰酸胍）等）。高濃度的鹽離子能夠有效屏蔽溶液中的靜電斥力。

同時，離液鹽離子還能競爭性地與磁珠表面以及核酸分子相結合，破壞二者表面原有的水化層，促進磁珠表面與核酸分子的吸附。

知識貼：離液鹽作用

當離子在水中溶解時，它們會與水分子相互作用，形成水合離子。這種水合離子的形成是由于水分子的極性和離子的電荷之間的相互作用。

由于常用的離液鹽如胍基離子（[CH?N?]?）對PCR有抑制作用，因此它們必須在后續(xù)的洗滌步驟中被去除。

知識貼：胍，胍鹽，鹽酸胍，異硫氰酸胍

a.胍是一個含氮的有機化合物，也稱“亞胺脲”，是吸濕性很強的無色晶體，易溶于水。胍是很強的一元堿，堿性與氫氧化鈉相近，能吸收空氣中的二氧化碳生成碳酸胍鹽。

胍可以和酸成鹽。其共軛酸胍鹽正離子(或稱胍鎓)是[CH?N?]?，pKa為14.5。胍在堿性條件下不穩(wěn)定，易水解為氨和尿素，在酸性條件下比較穩(wěn)定，故一般制成其鹽保存。

     

最后，核酸在低鹽高pH條件下從磁珠上洗脫下來。

2）羧基修飾磁珠

a.分類

ⅰ.氧化硅羧基磁珠

b.吸附原理

帶負電的羧基在適當?shù)碾x子強度和pH條件下，可以與核酸的磷酸骨架形成靜電相互作用。

常用核酸提取結合液，Si-OH磁珠和Si-COOH均能對核酸有效吸附。一般來說，在離液鹽體系，Si-OH磁珠對核酸吸附效果相對較優(yōu)；在PEG體系，Si-COOH對DNA和RNA吸附效果相對較好。

不同尺寸磁珠，懸浮差異明顯，尺寸越小懸浮性越好，但磁響應會減弱。一般用于核酸含量較低的小樣本，選用懸浮性好的磁珠效果更優(yōu)。

3）氨基/咪唑基等正電荷磁珠

氨基（NH?）的等電點約為9.5-9.9左右，當溶液pH值小于9.5，氨基磁珠的表面電荷為正。

氨基修飾的磁珠（等電點pH9.6）在酸性條件下帶正電，可以與核酸（等電點pH4.0）的負電荷通過靜電、氫鍵等相互作用結合。

氨基磁珠與DNA具有較強的結合能力，非常適合復雜樣本中核酸的富集和分離，但同時由于結合能力很強，核酸從磁珠表面釋放的條件較為苛刻。如果需要解離DNA，洗脫緩沖液pH推薦選擇10以上。

a.吸附

不同于羥基磁珠，表面帶正電荷的氨基磁珠與DNA的結合條件較為簡單。在pH為5.0-8.0時，并且在適宜濃度的鹽離子溶液中，更有助于氨基磁珠對DNA吸附。

在一定pH條件下，磁微粒表面氨基數(shù)量越多，吸附DNA越多。

b.洗脫

提高溶液pH可以使DNA從氨基磁珠表面脫附。另外，磷酸根離子、高濃度的NaCl（2-3M）也有同樣的效果。

PEG修飾可以減少非特異性吸附，提高核酸純度。如在處理血液樣本時，這種磁珠可以解決血紅蛋白干擾的問題。

2、磁珠和硅膠柱

硅膠柱回收DNA原理和磁珠差不多，不同的是大多數(shù)離心柱中吸附DNA的是一層硅膠膜，實際上就是一層玻璃纖維，其表面有大量修飾的硅羥基（Si-OH），硅羥基在溶液中解離后也帶負電，然后與帶正電鹽離子、帶負電DNA形成電橋，從而吸附住DNA。

參考文獻：

［1］解密磁珠表面化學：如何影響核酸提取效果-生科老王

［2］羧基磁珠供應商 - 上海伊普瑞生物

［3］磁珠法核酸DNA提取里常用的磁珠有羧基和羥基磁珠，兩個有什么區(qū)別嗎？-丁香實驗

［4］常見三種磁珠的使用原理-簡書

［5］核酸知識系列（三）|RNA|DNA|鹽酸胍|核酸|乙醇|濃度|-健康界

［6］一種核酸提取裂解/結合液、核酸提取溶液體系及試劑盒的制作方法

［7］一文看懂磁珠法提取核酸-湖北新縱科

［8］NGS丨一文讀懂磁珠法核酸提取-健康守望角